【摘要】：日本沼虾（ ，俗称青虾、河虾）是我国淡水虾养殖业的重要养殖品种之一。马尾气单胞菌（ ，又称马尾气单胞菌）是一类革兰氏阴性、兼性厌氧杆菌，广泛存在于淡水湖泊、河口等环境中，可感染人、畜及水生动物。日本沼虾感染马尾气单胞菌后，会出现软壳肢脱落、肌肉水肿、肝胰腺黄化等症状。 本研究针对日本沼虾免疫系统受到的感染情况，从组织病理学、酶活性、基因克隆表达和转录组分析四个不同层面系统地探究和分析了日本沼虾对抗细菌感染的免疫防御机制，为日本沼虾的免疫调控研究提供基础数据。本研究采用人工腹腔注射方式感染日本沼虾，根据感染后日本沼虾的累积死亡率及Koch氏改良公式计算得出24小时半数致死量为1.86x10~6CFU/mL。病理组织学分析显示，在病原菌感染下，日本沼虾鳃丝尖端肿胀，上皮层隆起，上皮细胞及支柱细胞排列紊乱； 肝胰腺内运输泡内颗粒物质逐渐消失，肝小管形态结构明显变形，星状管腔消失。酶活性检测表明，感染蚯蚓状气单胞菌后，肝胰腺中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、多酚氧化酶和溶菌酶活性呈先升高后降低的变化规律；超氧化物歧化酶和总抗氧化酶活性呈先降低后升高的趋势，且其活性水平总体低于对照组，48 h后恢复到对照组水平。
酶活性的升高显然是日本对虾对细菌感染作出积极反应的重要表现，而酶活性的抑制可能是机体受到毒力因子侵入，造成自身免疫细胞损伤的结果。随后本研究对感染6小时内的日本对虾濒死个体和48小时后的存活个体进行了高通量转录组测序分析。经过质量控制后，共使用340,554,126个clean reads进行转录组组装，得到120,858和61,345个，均进行了功能注释。GO分析显示，20,679个按照分子功能、生物过程和细胞成分进行了聚类，进一步分析得出56个功能亚类。按照KOG功能分类，共有9,577个被划分为26个功能类别。 10,922 个基因被定位到 KEGG 数据库中，预测出显著富集的通路，包括转运分解代谢、信号转导、脂质代谢和免疫系统。共鉴定出 232 个差异表达基因，包括 80 个上调基因，例如铜锌超氧化物歧化酶 (Cu Zn-SOD)、钳位结构域丝氨酸蛋白酶 (CDSP)、脂联素受体 (Adipo R)、丝氨酸蛋白酶 (SPs)；以及 152 个下调基因，例如几丁质酶 3 (CHIT3)、谷胱甘肽 S 转移酶 (GSTs)、细胞色素 P450 ()、组织蛋白酶 (CAPL)。
从差异表达基因中筛选出Alpha-2-、ADP 、g C1q R基因，采用荧光定量PCR和Blot技术分析它们在感染后不同时间点的mRNA和蛋白表达变化。结果表明，它们的表达量在感染蚯蚓气单胞菌后发生明显变化，证明它们参与了日本对虾的免疫防御反应。经过功能注释，差异表达基因主要富集在病原体识别、抗原加工与呈递、溶酶体、内吞作用、PI3K-AKT、JAK-STAT以及与机体代谢和免疫相关的IMD信号通路等方面。本研究利用RACE技术克隆了IMD信号通路转录因子基因全长c DNA序列。Mn基因全长5,049 bp，包括36 bp的5'非翻译区，3,519 bp的开放阅读框和1,494 bp的3'非翻译区。 预测Mn开放阅读区编码1,172个氨基酸。同源性分析表明，Mn基因编码的蛋白质含有保守的N端Rel同源结构域、C端Ik B-like结构域、C端死亡结构域，日本沼虾与罗氏沼虾氨基酸序列相似性最高；氨基酸系统发育树也显示其与罗氏沼虾首先聚成一个分支。qRT-PCR结果显示，Mn基因在肝胰腺和鳃组织中均有表达，且感染华氏气单胞菌后在肝胰腺组织中的表达量显著升高，表明该基因与日本沼虾的免疫防御反应有关。