1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种蜘蛛丝蛋白包涵体的纯化方法。
背景技术：
2、蜘蛛丝在自然界中是一种非常有吸引力的物质。它质轻、坚固、可生物降解，用途广泛。然而，天然蜘蛛丝的产量很低，而且蜘蛛是同类相食的，不能像蚕那样高密度养殖，严重限制了蜘蛛丝的应用。
3、随着生物技术的发展，研究人员开始探索通过基因工程技术重组表达蜘蛛丝蛋白来制备仿生蜘蛛丝。在这一领域，大肠杆菌作为表达系统是比较成熟的。然而，由于大肠杆菌缺乏真核生物中蛋白质折叠的关键元件，例如内质网和伴侣蛋白，因此一些真核衍生的蛋白质或对细胞有毒的蛋白质常常聚集形成包涵体蛋白。
4.传统的溶解包涵体蛋白的方法一般需要使用强变性剂，如8m尿素或6m盐酸胍。然而，变性的蛋白质需要缓慢去除变性剂，以将目标蛋白质从变性的拉伸状态恢复到正确的高阶结构。由于含有高浓度的变性剂在复性过程中需要多次更换缓冲液，因此需要大量的缓冲液且耗时且不利于工业化生产。因此，迫切需要开发一种快速、简便的蜘蛛丝蛋白包涵体纯化方法。
5、有鉴于此，提出本发明。
技术实现要素：
6、为了解决传统溶解包涵体的方法需要大量缓冲液、耗时长的问题，本发明提供了一种纯化蜘蛛丝蛋白包涵体的方法，该方法通过去除包涵体，可以简单、快速。通过分级离心去除杂质蛋白。可以实现蜘蛛丝蛋白包涵体的纯化，并可用于工业化生产。
7、具体地，本发明提供以下技术方案：
8、本发明提供了一种蜘蛛丝蛋白包涵体的纯化方法，包括：
9、步骤（1）、湿细菌细胞壁破壁后，分离出含有蜘蛛丝蛋白包涵体的沉淀i；
10、步骤（2），将沉淀i与含有尿素的缓冲液混合，分离出含有蜘蛛丝蛋白包合物的沉淀ii；
11、其中，所述含有尿素的缓冲溶液中，尿素的摩尔浓度为1～3m。
12、本发明意外发现，湿细菌细胞壁破碎后，用含1～3m尿素的缓冲液处理其沉淀物，有利于杂质蛋白的去除，有望实现细菌的纯化。蜘蛛丝蛋白内含物。
13、为了进一步提高蜘蛛丝蛋白包涵体的纯化效果，本发明对纯化方法进行了优化，具体如下：
14、 优选地，所述方法还包括：
15、步骤(3)，将沉淀ii与含有尿素的缓冲液再次混合，分离出含有蜘蛛丝蛋白包涵体的上清液，继续从上清液中分离出纯化的蜘蛛丝。蛋白质包涵体。
16、优选地，步骤(3)中，800-1200r/min离心分离含有蜘蛛丝蛋白的包涵体
上清液；
17. 优选的离心时间为1至3分钟。
18、优选地，步骤（3）中，8000μ/min离心，继续从上清液中分离得到纯化的蜘蛛丝蛋白包涵体；
19、离心时间优选18分钟以上，以达到分离效果。
20.出于能量消耗的原因，离心时间优选为18至30分钟。
21、本发明还发现，在用含尿素的缓冲液处理后得到的沉淀物ii中加入相同的缓冲液，800~1200r/min离心1~3分钟，可以去除沉淀物ii中的细胞壁，得到沉淀物ii。最大程度；分离的上清液以8000~/min离心18~30min以达到进一步纯化。
22、进一步以1000r/min离心3分钟，最大化沉淀物II中细胞壁的去除率；然后将分离的上清液以1/min离心20min以实现深度纯化。
23、优选地，步骤（1）中，以5000~7000r/min离心分离含有蜘蛛丝蛋白夹杂物的沉淀i；
24、离心时间优选14分钟以上，以达到分离效果。
25、出于能耗原因，离心时间最好可以为14
－
30分钟。
26、优选地，步骤（2）中，以8000μ/min离心分离含有蜘蛛丝蛋白夹杂物的沉淀ii；
27、离心时间优选14分钟以上，以达到分离效果。
28.出于能量消耗的原因，离心时间优选为14至30分钟。
29、本发明步骤（1）和（2）中，采用上述条件进行离心，可以使更多的相关蛋白吸附在固体物质上，有利于后续步骤的纯化。
30、优选地，所述方法还包括：重复步骤(2)1至3次，进行沉淀ii。
31.进一步重复步骤(2)一次，进行沉淀ii。
32、优选地，步骤（1）中，所述破壁具体包括： 使用含有蛋白酶抑制剂的缓冲液对湿细菌细胞进行破壁；
33、所述蛋白酶抑制剂选自pmsf、tlck、tpck、亮肽素、aebsf、焦磷酸钠、磷酸β甘油中的一种或多种；
34、进一步地，所述蛋白酶抑制剂为pmsf；
35、进一步地，所述含有蛋白酶抑制剂的缓冲液中，所述蛋白酶抑制剂的摩尔体积浓度为0.5-2m。
36.优选地，含有蛋白酶抑制剂的缓冲液可以选自tris缓冲液和PBS缓冲液。
37、具体实施例中使用的tris体系的缓冲液中含有tris
－
盐酸和氯化钠；
38.其中，三
－
HCl的pH值为8.0，其摩尔浓度为18-22m； nacl的摩尔浓度为0.4-0.6m。
39.优选地，含有尿素的缓冲液还含有tris
－
盐酸和氯化钠；
40.其中，三
－
HCl的pH值为8.0，其摩尔浓度为18-22m； nacl的摩尔浓度为0.4-0.6m。
41、本发明中，用上述含有蛋白酶抑制剂的缓冲液处理湿细菌细胞，有利于初步去除杂质蛋白；然后用上述含尿素的缓冲液处理沉淀物，有利于深度去除杂质蛋白。
42、这样，本发明通过分级沉淀的方法得到纯化的蜘蛛丝蛋白包涵体。
43、优选地，步骤(1)中，所述含有蛋白酶抑制剂的缓冲液的添加量为湿菌体质量的4～6倍。
44、优选地，步骤（2）中，所述含尿素缓冲液的添加量为湿菌体质量的4~6倍。
45、作为本发明的优选技术方案，该方法包括以下步骤：
46.（1）用含有蛋白酶抑制剂的缓冲液破壁湿菌细胞壁后，5000-7000r/min离心14分钟以上，分离出含有蜘蛛丝蛋白夹杂物的沉淀i；
47、其中，所述蛋白酶抑制剂的摩尔浓度为0.5-2m；缓冲液的pH值为8.0，摩尔浓度为18-22m；
48. (2)将沉淀i与含尿素的缓冲液混合，8000℃/min离心14分钟以上，分离得到的沉淀，重复步骤(2)1～3次，得到蜘蛛丝蛋白包涵体。降水ii；
49、其中，尿素的摩尔浓度为1-3m；缓冲液的pH值为8.0，摩尔浓度为18-22m；；
50. (3)将沉淀II与含尿素的缓冲液再次混合，800-1200r/min离心1-3min，然后分离上清液，8000r/min离心18min以上。沉淀物即为纯化后的蜘蛛丝蛋白包涵体。
51、与现有技术相比，本发明的有益效果是：
52、本发明直接采用离心方法纯化蜘蛛丝蛋白包涵体。操作简单，简化了蛋白质纯化和复性步骤，可以获得较纯的蜘蛛丝蛋白包涵体。同时节省了时间，降低了成本，并用于工业生产。
附图说明
53、图1为示意图；
54、图2为实施例1步骤(3)中两次离心后沉淀物和上清液的电泳分析结果；
55、图3为不同尿素浓度下蜘蛛丝蛋白内含物的电泳分析结果；
56、图4为蜘蛛丝蛋白内含物在不同离心条件下的电泳分析结果；
57、图5为蜘蛛丝蛋白内含物在不同离心条件下的电泳分析结果；
58、图6为蜘蛛丝蛋白内含物在不同重复次数、不同尿素浓度下的电泳分析结果；
59、图7为按照实施例方法纯化的蜘蛛丝蛋白包涵体的电泳分析结果。
具体实施
60、下列实施例用于说明本发明，但并不限制本发明的范围。
61、实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域文献记载的技术或条件，或者按照产品说明书。所用试剂或仪器如未注明生产厂家，均为常规产品，可通过正规渠道购买。
62. 实施例1
63、 本实施例提供了一种蜘蛛丝蛋白包涵体的纯化方法，包括以下步骤：
64. (1) 称取 30g 湿细菌细胞，加入 150g 含有蛋白酶抑制剂的缓冲液 [20mm tris
－
hcl(ph8.0)+0.5m nacl+1mm pmsf]，剪切均质破壁后，6000r/min离心15min，弃去
去除上清液（污染蛋白），得到沉淀i；
[0065]
(2)加入150g含有尿素的缓冲溶液[20mm tris
－
hcl(ph8.0)+0.5m nacl+2m尿素]，剪切后10000℃离心15分钟，弃上清，分离得到的沉淀，重复步骤(2)一次，得到沉淀ii(即初步纯化的沉淀)。蜘蛛丝蛋白包涵体）；
[0066]
(3) 添加含有尿素的缓冲液[20mm tris
－
hcl(ph8.0)+0.5m nacl+2m 尿素]，剪切后1000r/min离心1~3min去除细胞壁，分离上清液18~22min/min离心深度纯化，所得沉淀物即为纯化的蜘蛛丝包涵体。
[0067]
分别取本实施例步骤（3）中第一次离心和第二次离心后的沉淀和上清液进行电泳分析；结果如图1和图2所示；其中图1为示意图。 1 可以看出蜘蛛丝蛋白处于45kd。
[0068]
实施例2
[0069]
本实施例提供了一种蜘蛛丝蛋白包涵体的纯化方法，包括以下步骤：
[0070]
(1)称取湿菌细胞30g，向湿菌细胞中加入150g含有蛋白酶抑制剂的缓冲液[20mm PBS+0.5m nacl+1mm pmsf]，剪切匀浆破壁，6000r/min离心15后分钟，弃去上清液（污染蛋白），得到沉淀i；
[0071]
(2)向沉淀i中加入150g含有尿素的缓冲液[20mm PBS+0.5m nacl+2m尿素]。剪切后，10,000离心15分钟，弃去上清液，对分离的沉淀重复上述步骤。 (2)一次得到沉淀ii(即初步纯化后的蜘蛛丝蛋白包涵体)；
[0072]
(3) 在沉淀II中加入含有尿素的缓冲液[20mm PBS+0.+2m尿素]。剪切后，1000r/min离心1～3分钟，除去细胞壁，然后分离上清液。 /min离心18-22分钟进行深度纯化，所得沉淀即为纯化的蜘蛛丝蛋白包涵体。
[0073]
对比实施例1
[0074]
为了验证含尿素的缓冲液有利于杂质蛋白的去除，从而实现蜘蛛丝蛋白包涵体的纯化，本对比例提供了一种蜘蛛丝蛋白包涵体的纯化方法。与实施例1的区别仅在于以下步骤： (2)中，含有尿素的缓冲溶液中，尿素的摩尔浓度分别为4m、6m、8m。
[0075]
分别取实施例1和对比例1步骤(2)的上清液进行电泳分析。
[0076]
图3显示了不同尿素浓度缓冲液中获得的上清液的电泳分析结果。从图3可以看出，含有2m尿素的缓冲液可以去除杂质蛋白，且几乎不溶解目标蛋白，而含有4m、6m、8m尿素的缓冲液可以去除杂质。缓冲液会溶解目标蛋白质并导致蛋白质损失。
[0077]
对比实施例2
[0078]
为了验证步骤(3)中的第一次离心有利于细胞壁的去除，从而实现蜘蛛丝蛋白包涵体的纯化，本对比例提供了一种纯化蜘蛛丝蛋白包涵体的方法，该方法仅与实施例1不同的是，步骤(3)中，第一次离心的条件为：500r/min离心30分钟，500r/mi离心45分钟。 5分钟。
[0079]
实施例1和对比例2的步骤(3)中，第一次离心后，分别取上清液和沉淀进行电泳分析。
[0080]
图4和图5显示了不同离心条件下蜘蛛丝蛋白内含物的电泳分析结果。从图4和图5可以看出，1000r/min离心1～3分钟后目的蛋白变化不大。
[0081]
对比例3
[0082]
为了验证步骤(2)中的重复次数和步骤(3)中含有尿素的缓冲液的浓度有利于杂质蛋白的去除，从而实现蜘蛛丝蛋白包合物的纯化，本对比例提供纯化蜘蛛丝蛋白包涵体法与实施例1的唯一区别在于：
[0083]
步骤(2)中，将分离出的沉淀物重复步骤(2)3次；每次重复该步骤后得到的上清液的电泳分析结果如图6所示；
[0084]
在步骤 (3) 中，添加含有尿素 [20 mm tris
－
hcl(ph8.0)+0.5m nacl+8m尿素];所得上清液和沉淀物的电泳分析如图 6 所示。
[0085]
如图6所示，对于分离出的沉淀物，重复步骤(2)一次，效果较为理想；和含有尿素的缓冲液 [20 mm tris
－
hcl(ph8.0)+0.5m nacl+8m尿素]，虽然也能溶解目的蛋白，但溶解率只有50%左右，而且很大一部分目的蛋白残留在沉淀中，导致大量损失。
[0086]
对比例4
[0087]
本对比示例是根据中间的示例进行的，具体操作如下：
[0088]
(1)称取30g湿细菌细胞，加入150g含有蛋白酶抑制剂的缓冲液[20mm tris
－
hcl(ph8.0)+0.5m nacl+1mm pmsf]，剪切均质破壁后，6000r/min离心15分钟，弃上清液(不纯蛋白)，得沉淀i；
[0089]
(2)加入150g含有尿素的缓冲溶液[20mm tris
－
hcl(ph8.0)+0.5m nacl+4m尿素]，剪切后，将悬浮液加热至90℃，使重组蜘蛛丝蛋白包涵体蛋白溶解。 /min，20min，取上清进行电泳分析；电泳分析结果如图7所示。
[0090]
从图7可以看出，高温下蜘蛛丝蛋白并没有溶解在上清液中，大部分蛋白仍然有沉淀。
[0091]
以上虽然通过一般性说明和具体实施例对本发明进行了详细说明，但是对于本领域的技术人员来说，显然本发明可以对本发明进行各种修改或改进。因此，凡在不脱离本发明精神的情况下所作的修改或改进，均落入本发明的保护范围。